Το 1309 το νησί πουλήθηκε στο τάγμα των Ιπποτών του Αγίου Ιωάννη της Ιερουσαλήμ.Το τάγμα ιδρύθηκε τον 12ο αιώνα στην Ιερουσαλήμ με στόχο την νοσηλεία και περίθαλψη των προσκυνητών και σταυροφόρων αλλά πολύ σύντομα μετεξελίχθηκε σε μάχιμη στρατιωτική μονάδα η οποία απέκτησε μεγάλες εκτάσεις γης.
Έχοντας οπισθοχωρήσει από την Ιερουσαλήμ και αργότερα από την Κύπρο, το τάγμα ίδρυσε την έδρα του στη Ρόδο και απέκτησε κατά την χρονική περίοδο αυτή ηγετικό ρόλο στην Ανατολική Μεσόγειο.
Κατά την διάρκεια της παραμονής των Ιπποτών στη Ρόδο, οι οχυρώσεις επεκτάθηκαν, εκσυγχρονίσθηκαν και συνεχώς ενισχύονταν. Ένα νοσοκομείο, ένα παλάτι, αρκετές εκκλησίες ήταν ορισμένα από τα πολλά δημόσια κτίρια τα οποία αναγέρθηκαν την εποχή αυτή. Τα κτίρια αυτά αποτελούν αξιοσημείωτα παραδείγματα της Γοτθικής και Αναγεννησιακής αρχιτεκτονικής. Παρόλες τις προστριβές που υπήρχαν με την Οθωμανική Αυτοκρατορία, το θαλάσσιο εμπόριο αποτελούσε πηγή πλούτου και οι αγορές της πόλης ήταν ακμάζουσες. Την περίοδο της κατοχής των Ιπποτών το νησί της Ρόδου διήγε περίοδο ακμής και οι σχέσεις μεταξύ των Ιπποτών και των ντόπιων χαρακτηρίζονταν από ανοχή και συχνά από στενή συνεργασία. Οι περισσότεροι από τους δρόμους της Μεσαιωνικής πόλης συμπίπτουν με τους δρόμους της αρχαίας πόλης ενώ διατηρήθηκε η διαίρεση της πόλης σε δύο ζώνες. Το τάγμα στη Ρόδο διατηρούσε ένα πολύ καλά οργανωμένο αρχείο το οποίο περιλάμβανε έγγραφα που είχαν εκδοθεί από τις διοικητές αρχές, αλληλογραφία, νομικά έγγραφα κ.α.
Το αρχείο αυτό διατηρείται έως τις μέρες μας και σώζεται στην Εθνική Βιβλιοθήκη της Μάλτας. Το αρχείο αυτό αποτελεί μια αξιόλογη πηγή πληροφόρησης για την περίοδο αυτή.
Η πόλη είχε διαιρεθεί σε δύο ζώνες με ένα εσωτερικό τείχος. Το βόρειο τμήμα το οποίο ήταν γνωστό ως Chastel, Chateau, Castrum, Castellum ή Conventus, όπου βρισκόταν το παλάτι του Μεγάλου Μαγίστρου, ο καθολικός καθεδρικός ναός και η κατοικία του καθολικού επισκόπου, τα καλύμματα των «γλωσσών», οι κατοικίες των Ιπποτών, ένα νοσοκομείο κ.α. Το νότιο τμήμα γνωστό ως ville, burgus ή burgum ήταν η περιοχή όπου ζούσαν οι λαϊκοί και περιλάμβανε την αγορά, συναγωγές, εκκλησίες καθώς και δημόσια και εμπορικά κτίρια.