Το 1522 οι Οθωμανοί Τούρκοι κατέκτησαν την πόλη μετά από μια δεύτερη μακρά πολιορκία. Νέα κτίρια κατασκευάστηκαν: Τζαμιά, δημόσια λουτρά και κατοικίες για τους νέους κατακτητές. Οι Έλληνες υποχρεώθηκαν να εγκαταλείψουν την οχυρωμένη πόλη και να μετοικήσουν σε περιοχές εκτός των τειχών.
Κατά την περίοδο της Οθωμανικής κυριαρχίας, η Ρόδος έχασε τον διεθνή της χαρακτήρα. Η πόλη διατήρησε την κύρια οικονομική της λειτουργία ως αγορά αγροτικών προϊόντων για το εσωτερικό τμήμα του νησιού καθώς και των τριγύρω μικρών νησιών.
Μετά την εγκαθίδρυση της κυριαρχίας τους στο νησί, οι Οθωμανοί Τούρκοι επιδιόρθωσαν τα τείχη που είχαν υποστεί ζημιές, μετέτρεψαν τις περισσότερες εκκλησίες σε τζαμιά και μεταρρύθμισαν τις μεγάλες κατοικίες σε ιδιωτικά ή δημόσια κτίρια. Οι παραπάνω μετατροπές αποτέλεσαν μια μακροχρόνια διαδικασία που είχε σαν στόχο να αναμορφώσουν και να προσομοιάσουν τα κτίρια έτσι ώστε να ταιριάζουν με τον Οθωμανικό τρόπο ζωής.
Οι προσόψεις των κτιρίων της περιόδου των Ιπποτών με τους σκαλιστούς τους διακόσμους, τις τοξωτές πύλες και τους πέτρινους πελεκητούς τοίχους, εμπλουτίστηκαν με τα τυχαία χαρακτηριστικά της Οθωμανικής Αρχιτεκτονικής προσαρμοσμένης όμως στο τοπικό κλίμα και πολιτισμό. Στα πλαίσια της διαδικασίας αυτής, τα αρχιτεκτονικά χαρακτηριστικά των υπαρχόντων κτιρίων διατηρήθηκαν. Οι πιο χαρακτηριστικές προσθήκες ήταν τα λουτρά (συνήθως στο πίσω μέρος των σπιτιών) κα τα ξύλινα κλειστά μπαλκόνια στις προσόψεις των σπιτιών πάνω από στενούς δρόμους. Έτσι, τα περισσότερα κτίρια της εποχής των Ιπποτών στη Μεσαιωνική πόλη ήταν καλά διατηρημένα. Το αποτέλεσμα ήταν ένα μείγμα ανατολικής αρχιτεκτονικής με έντονα δυτικά στοιχεία που είχαν παραμείνει και νέα κτίρια που κτίσθηκαν με το ύφος της τότε τοπικής αρχιτεκτονικής.
Τον 19ο αιώνα η παρακμή της Οθωμανικής Αυτοκρατορίας είχε σαν αποτέλεσμα την παραμέληση της πόλης και των κτιρίων της τα οποία υπέστησαν περαιτέρω φθορά λόγω των δυνατών σεισμών που συχνά πλήττουν την περιοχή.